時(shí)間：2023-08-31 16:37:23
導(dǎo)語：在生物信息學(xué)分析的撰寫旅程中，學(xué)習(xí)并吸收他人佳作的精髓是一條寶貴的路徑，好期刊匯集了九篇優(yōu)秀范文，愿這些內(nèi)容能夠啟發(fā)您的創(chuàng)作靈感，引領(lǐng)您探索更多的創(chuàng)作可能。
關(guān)鍵詞：牦牛；金屬硫蛋白3基因；生物信息學(xué)分析
作者簡(jiǎn)介：李潔（1982—），女，河南商丘人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖工作。聯(lián)系電話：（0931）7631225。E-mail：lijie@gsau.edu.cn。
通信作者：王建福（1982—）男，河南商丘人，講師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖工作。聯(lián)系電話：（0931）7631225。E-mail：wangjf@gsau.edu.cn。
定西市安定區(qū)位于甘肅省中部，北緯35°17′54″至36°02′40″，東經(jīng)104°12′48″至105°01′06″，南北長(zhǎng)82.9km，東西寬73.3km，海拔1700～2580m，屬典型的黃土高原干旱半干旱雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，抗旱生產(chǎn)是安定區(qū)農(nóng)業(yè)工作的重點(diǎn)。中晚熟玉米適宜海拔在2000m以下的區(qū)域種植[1]，而安定區(qū)大面積耕地海拔在2000m以上，中晚熟品種很難成熟，全膜雙壟溝播技術(shù)將玉米種植范圍擴(kuò)大到海拔2100m區(qū)域[2-3]。為了考察早熟玉米新品種在安定區(qū)高海拔區(qū)的適應(yīng)性、抗逆性、生產(chǎn)穩(wěn)定性，2017年安定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心引進(jìn)了7個(gè)早熟玉米新品種進(jìn)行比較試驗(yàn)，以期篩選出適合當(dāng)?shù)睾０?100m以上區(qū)域生產(chǎn)應(yīng)用的玉米品種?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。
1材料與方法
1.1供試材料
參試玉米品種7個(gè)，其中武科早303、武科早304由武威市武科種業(yè)科技有限公司生產(chǎn)，甘玉804由甘肅種業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，興達(dá)1601、興達(dá)1602由甘肅興達(dá)種業(yè)有限公司生產(chǎn)，金穗606、金穗607及當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)種植品種金穗3號(hào)（CK）由白銀金穗種業(yè)有限公司生產(chǎn)。
1.2試驗(yàn)地概況
試驗(yàn)設(shè)在定西市安定區(qū)團(tuán)結(jié)鎮(zhèn)小山村，海拔2150m，年平均降水量430mm，年蒸發(fā)量1450mm，無霜期141d。前茬作物收獲后深耕曬垡，冬前淺耕耙耱。采用全膜雙壟溝播技術(shù)[4]，大壟寬70cm、高10cm，小壟寬40cm、高15cm。覆膜前結(jié)合整地一次性基施農(nóng)家肥45000kg/hm2、玉米專用肥（N-P2O5-K2O為20-15-15）1200kg/hm2。用50%辛硫磷乳油7.5kg/hm2加適量水噴拌細(xì)土450kg制成毒土，撒施地面后起壟覆膜以防治地下害蟲。用50%乙草胺乳油3750mL/hm2兌水600kg噴灑于壟溝表面芽前除草。
1.3試驗(yàn)方法
試驗(yàn)為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每品種為1個(gè)處理，3次重復(fù)，小區(qū)面積39.6m2（11.0m×3.6m）。4月19日用玉米點(diǎn)播器播種，每穴2粒，播深4cm，行距55cm，株距30cm，密度為60000株/hm2。田間管理措施同當(dāng)?shù)卮筇?。田間觀察記載物候期及主要農(nóng)藝性狀，成熟后按小區(qū)抽樣考種并單收計(jì)產(chǎn)。
2結(jié)果與分析
2.1生育期
從表1可以看出，各品種出苗期一致，均在5月2日。金穗607、武科早303、甘玉804、武科早304于6月中旬開始拔節(jié)，與金穗3號(hào)（CK）基本一致；興達(dá)1601、金穗606、興達(dá)1602拔節(jié)期較金穗3號(hào)（CK）遲13～16d。抽雄期武科早303、武科早304均為7月11日，較金穗3號(hào)（CK）早4d；興達(dá)1602與金穗3號(hào)（CK）一致；金穗606、興達(dá)1601、甘玉804較金穗3號(hào)（CK）晚2d。成熟期武科早303、武科早304、興達(dá)1602最早，8月下旬已經(jīng)成熟，較金穗3號(hào)（CK）早9d；金穗607、甘玉804、興達(dá)1601、金穗606均在9月上旬與金穗3號(hào)（CK）同期成熟。生育期武科早303、武科早304、興達(dá)1602均為117d，較金穗3號(hào)（CK）短9d；其他品種生育期為126d，與金穗3號(hào)（CK）相同。
2主要性狀
由表2可見，株高以金穗607、甘玉804、興達(dá)1601最高，均為2.5m，較金穗3號(hào)（CK）高出0.5m；武科早304、金穗606次之，均為2.4m，較金穗3號(hào)（CK）高出0.4m；武科早303、興達(dá)1602最低，為1.7m，較金穗3號(hào)（CK）低0.3cm。穗位以甘玉804、金穗606最高，為80.0cm，較金穗3號(hào)（CK）高12.5cm；金穗607次之，為73.0cm，較金穗3號(hào)（CK）高5.5cm；武科早303最低，為36.5cm，較金穗3號(hào)（CK）低31.0cm。穗長(zhǎng)以興達(dá)1601最長(zhǎng)，為23.0cm，較金穗3號(hào)（CK）長(zhǎng)5.0cm；其次為甘玉804，為21.5cm，較金穗3號(hào)（CK）長(zhǎng)3.5cm；武科早304最短，為17.5cm，較金穗3號(hào)（CK）短0.5cm；其他品種較金穗3號(hào)（CK）長(zhǎng)0.5～2.0cm。穗粗以金穗606最粗，為15.6cm，較金穗3號(hào)（CK）粗0.1cm，其他品種較金穗3號(hào)（CK）細(xì)0.2～2.3cm。軸粗以武科早304最粗，為10.8cm，較金穗3號(hào)（CK）粗0.8cm；其次是金穗606，為10.3cm，較金穗3號(hào)（CK）粗0.3cm；其他品種較金穗3號(hào)（CK）細(xì)0.3～0.7cm。粒型武科早304、興達(dá)1602與金穗3號(hào)（CK）一致，均為半馬齒型，其余品種均為馬齒型。粒色除武科早303、武科早304為黃紅色外，其余品種均與金穗3號(hào)（CK）一致，為黃色。軸色金穗607、甘玉804、興達(dá)1602為淺粉色；武科早303、興達(dá)1601、金穗606和金穗3號(hào)（CK）均為棕紅色；武科早304為白色。
2.3產(chǎn)量及構(gòu)成因子
由表3可知，穗粒數(shù)金穗607最多，為630粒，較金穗3號(hào)（CK）多132粒；其次是甘玉804，為552粒，較金穗3號(hào)（CK）多54粒；其余品種均較金穗3號(hào)（CK）少。百粒重以金穗606最高，為31.6g，較金穗3號(hào)（CK）高8.2g；其次是武科早303，為28.4g，較金穗3號(hào)（CK）高5.0g；武科早304、興達(dá)1601分別為27.7、24.5g，較金穗3號(hào)（CK）分別高4.3、1.1g；其余品種均低于金穗3號(hào)（CK）。折合產(chǎn)量以武科早304最高，為8737.4kg/hm2，較金穗3號(hào)（CK）增產(chǎn)1186.9kg/hm2，增產(chǎn)率為15.7%；其次是武科早303，為8611.1kg/hm2，較金穗3號(hào)（CK）增產(chǎn)1060.6kg/hm2，增產(chǎn)率14.0%；金穗607居第3位，折合產(chǎn)量8585.9kg/hm2，較金穗3號(hào)（CK）增產(chǎn)13.7%；金穗606為8484.9kg/hm2，較金穗3號(hào)（CK）增產(chǎn)12.4%。對(duì)產(chǎn)量進(jìn)行新復(fù)極差比較，各品種間產(chǎn)量差異均達(dá)到極顯著水平。
3小結(jié)
在安定區(qū)海拔2150m的旱區(qū)，對(duì)引進(jìn)的7個(gè)玉米品種進(jìn)行了引種試驗(yàn)。結(jié)果表明，參試各玉米品種均可在9月中旬前成熟，武科早304、武科早303、金穗607、金穗606等4個(gè)品種綜合性狀優(yōu)良。其中武科早304折合產(chǎn)量最高，為8737.4kg/hm2，較對(duì)照品種金穗3號(hào)增產(chǎn)1186.9kg/hm2，增產(chǎn)率為15.7%；武科早303折合產(chǎn)量8611.1kg/hm2，較對(duì)照品種金穗3號(hào)增產(chǎn)1060.6kg/hm2，增產(chǎn)率14.0%；金穗607折合產(chǎn)量8585.9kg/hm2，較對(duì)照品種金穗3號(hào)增產(chǎn)13.7%；金穗606較對(duì)照品種金穗3號(hào)增產(chǎn)12.4%。
張雷等人[5]認(rèn)為全膜雙壟溝播栽培玉米可在海拔2300m以內(nèi)的區(qū)域內(nèi)種植。本試驗(yàn)通過對(duì)供試玉米品種的性狀、生育期及產(chǎn)量結(jié)果進(jìn)行綜合分析，建議在安定區(qū)海拔2100～2300m區(qū)域擴(kuò)大武科早304、武科早303、金穗607及金穗606的種植面積，其他品種可在海拔2100m以下區(qū)域進(jìn)一步試驗(yàn)。
參考文獻(xiàn)：
[1] 劉廣才，楊祁峰，李來祥，等. 旱地玉米全膜雙壟溝播技術(shù)增產(chǎn)效果研究[J]. 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，2009，30（6）：739-743.
[2] 牛建彪. 半干旱區(qū)小麥玉米雨水高效利用技術(shù)模式[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2005（5）：22-23.
關(guān)鍵詞：鐵皮石斛，RCA2基因，克隆，生物信息學(xué)分析
中圖分類號(hào)：Q949.71
文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
鐵皮石斛（Dendrobiumofficinale）屬于蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生的草本植物，鐵皮石斛含石斛多糖、石斛堿、雙芐酚類、菲酚類等多種藥效成分，是石斛屬藥用植物中最為珍稀名貴的種，具有滋陰清熱、潤(rùn)肺止咳、益胃生津、明目強(qiáng)身等作用（Zhangetal，2000）。核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose1，5bisphosphatecarboxylase/oxygenase，Rubisco）是存在于葉綠體內(nèi)的一個(gè)雙功能酶，同時(shí)催化卡爾文循環(huán)中最初固定CO2的反應(yīng)以及光呼吸作用中的第一步反應(yīng)，該酶處于光合碳還原和碳氧化兩個(gè)方向相反但又相互關(guān)聯(lián)的循環(huán)交叉點(diǎn)上，對(duì)凈光合速率起著決定性的影響，因此提高Rubisco活力是提高光合作用的重要途徑（潘瑞熾等，2004）。因鐵皮石斛原生地的生境破壞和常年的濫采亂挖，野生資源遭到嚴(yán)重的破壞，瀕臨滅絕，已列入中國珍稀瀕危保護(hù)植物的名錄。由于石斛不能夠栽培在土壤里，北方地區(qū)必須栽培在樹皮、木塊、鋸末等做的栽培床或者是石頭上，冬天多數(shù)需要蓋溫棚等設(shè)施，投資較大，加上石斛種植的技術(shù)要求高，目前市場(chǎng)尚未完全打開，發(fā)展速度還不是很快（張明等，2010）。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，許多糧食作物如大麥（Rundle&Zielinski，1991）、水稻（Toetal，1999）、大豆（Yinetal，2014）等植物的RCA基因被克隆，但目前報(bào)道的RCA基因很少有涉及藥用觀賞植物，最近有朱明庫等（2013）對(duì)羽衣甘藍(lán)Rubisco活化酶基因BoRCA的克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析的研究；袁秀云等（2016）對(duì)蝴蝶蘭Rubisco活化酶基因PhRCAα的序列特征及在低溫脅迫下的表達(dá)分析的研究；祝欽瀧等（2011）對(duì)彩葉草Rubisco活化酶基因SsRCA進(jìn)行了組織表達(dá)特異性和光誘導(dǎo)表達(dá)特性研究；曾淑華等（2012）已從鐵皮石斛中克隆了光合碳途徑關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。因此，開展鐵皮石斛RCA基因研究顯得尤為必要。本研究為了提高石斛的質(zhì)量，提高石斛光合效率，揭示鐵皮石斛光合作用機(jī)理自然成了鐵皮石斛研究領(lǐng)域的重要問題，該研究利用RACE技術(shù)克隆出鐵皮石斛RCA2全長(zhǎng)基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究鐵皮石斛光合作用調(diào)節(jié)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
鐵皮石斛原產(chǎn)地為貴州，現(xiàn)在種植于河南省鄭州市鄭州師范學(xué)院蘭花工程技術(shù)研究中心智能日光溫室，植物材料為一年生鐵皮石斛。
1.2方法
1.2.1RNA提取選取一年生鐵皮石斛葉片，液氮速凍，保存于-80℃冰箱備用。葉片總RNA提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen公司）；采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性；采用QuawellQ5000微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其A260/A280值及其濃度。
1.2.2RCA2基因全長(zhǎng)的克隆以提取的葉片總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA。根據(jù)GENBANK上已知植物的RCA保守區(qū)，利用DNAMAN和Primer5.0生物軟件設(shè)計(jì)兼并引物（表1），擴(kuò)增RCA保守片段。PCR反應(yīng)體系為20.0μL：10×PCRbuffer2.0μL、dNTPMix2.0μL、上游引物RCAF1（10μmol·L1）1.0μL、下游引物RCAR1（10μmol·L1）1.0μL、模板cDNA1.0μL、rTaq酶（5U·μL1）0.2μL，加滅菌雙蒸水至總體積20.0μL；反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。切膠回收目的片段，連接pGEMTEasy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆送至上海英濰捷基生物技術(shù)公司測(cè)序，獲得RCA基因的保守區(qū)序列。再根據(jù)獲得的保守區(qū)序列，分別設(shè)計(jì)5′端和3′端特異性巢式引物（表1），以葉cDNA為模板，用巢式PCR方式分別擴(kuò)增RCA的5′端和3′端序列，按Clontech公司SMARTerTMRACE擴(kuò)增試劑盒操作說明進(jìn)行反應(yīng)，回收擴(kuò)增目的產(chǎn)物，克隆到pGEMTEasy載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，進(jìn)行測(cè)序和拼接。
1.2.3ORF的擴(kuò)增根據(jù)DNAMAN軟件拼接得到RCA基因序列全長(zhǎng)，利用Premier5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物RCAF2和RCAR2（表1），用于完整開放閱讀框（ORF）的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸15min。ORF片段連接到pGEMTEasy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測(cè)序進(jìn)行ORF序列驗(yàn)證。
1.2.4生物信息學(xué)分析利用ORFfinder進(jìn)行開放閱讀框的預(yù)測(cè)；利用NCBI上的BLAST進(jìn)行基因相似性的分析（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast/）；利用DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析；利用ProtScale程序（http：//expasy.org/tools/protscale.html）分析蛋白質(zhì)親疏水性；利用TargetP軟件（UsingPLANTnetworks）和PSORTll（http：//psort.hgc.jp/form.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位的分析；利用Protfun（http：//cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析預(yù)測(cè)RCA2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和功能分類；利用ExPASy網(wǎng)站上的GOR進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用ExPASy網(wǎng)站上的SWISSMODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析。
2結(jié)果與分析
2.1RCA2基因全長(zhǎng)克隆
葉片總RNA提取后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，檢測(cè)結(jié)果顯示，28S和18S條帶清晰，A260/A280值1.96，濃度為210.56ng·μL1。
以鐵皮石斛葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以兼并引物RCAF1和RCAR2進(jìn)行保守區(qū)片段PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)503bp保守片段（圖1：B），根據(jù)設(shè)計(jì)的3′端和5′端特異引物，采用RACE技術(shù)，擴(kuò)增獲得3′端目的片段（圖1：D）和5′端目的片段（圖1：C）。利用生物軟件DNAMAN進(jìn)行序列拼接得到該基因的全長(zhǎng)為1730bp，利用ORFfinder分析，共有9個(gè)ORF，該基因最長(zhǎng)的ORF共計(jì)1323bp，包含81bp的5′UTR、326bp的3′UTR，編碼440個(gè)氨基酸，將該基因命名為RCA2，GenBank登陸號(hào)為KT205842。利用引物RCAF2和RCAR2擴(kuò)增獲得1323bpORF片段（圖1：A），連接到pGEMTEasy載體上測(cè)序驗(yàn)證，得到的陽性質(zhì)粒命名為pGEMRCA2。
2.2RCA2基因全長(zhǎng)的生物信息學(xué)分析
2.2.1RCA2核苷酸及編碼蛋白序列的理化性質(zhì)利用blastp和DNAMAN對(duì)RCA2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該基因包含PloopNTPaseSuperfamily結(jié)構(gòu)域，分別為“WGGKGQGKS”（A區(qū)）和“GKMCCLFINDLD”（B區(qū)），屬于PloopNTPase超家族基因（圖2）。理化性質(zhì)分析該蛋白的分子質(zhì)量為48.53kDa，等電點(diǎn)為6.19。將該基因全長(zhǎng)核苷酸序列在NCBI上進(jìn)行blastn相似性比較，結(jié)果表明基因均為RCA基因，且與蝴蝶蘭（Phalaenopsis）的相似性高達(dá)87%。氨基酸序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與蝴蝶蘭、葡萄、荷花的相似性分別為89%、84%、85%（圖3）。
2.2.2RCA2編碼蛋白質(zhì)的親疏水性分析利用ProtScale分析蛋白的親疏水性發(fā)現(xiàn)，RCA2蛋白質(zhì)序列具有較高的親水性，其中第69位的Thr親水性最強(qiáng)（-3.078），第162位Leu的疏水性最強(qiáng)（2.122）（圖4）。
2.2.3RCA2編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位蛋白的亞細(xì)胞定位與該蛋白所執(zhí)行的功能是密切相關(guān)的，用TargetP和PSORTII軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，TargetP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示RCA2蛋白定位于葉綠體基質(zhì)，可信度為3（圖5：A），用PSORTII預(yù)測(cè)蛋白顯示，RCA2蛋白定位于葉綠體基質(zhì)、線粒體基質(zhì)間隙、葉綠體類囊體膜、葉綠體類囊體腔，RCA2蛋白主要存在于葉綠體基質(zhì)（圖5：B）。
2.2.4RCA2編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)與分析利用ProtfunsoftwareofCBS分析預(yù)測(cè)RCA2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和功能分類，可能有意義的功能包括中間代謝、脂肪酸代謝、翻譯、輔酶因子的生物合成和能量代謝等，他們的幾率分別是5.484、4.387、4.048、3.639、3.098。這表明RCA2在中間代謝起到了一個(gè)非常重要的角色，在脂肪酸代謝、翻譯中起到了重要作用，在輔酶因子的生物合成和能量代謝中也起到了關(guān)鍵作用。
2.2.5RCA2編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用ExPASy網(wǎng)站上的GOR進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，α螺旋占30.68%，延伸鏈占25.45%，不規(guī)則折疊占43.86%（圖6）。用ExPASy網(wǎng)站上的SWISSMODELWorkspace預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)以4w5w.1.A（SMTLid）為模板進(jìn)行建模，該模板以XRAY2.90方法產(chǎn)生，與RCA2蛋白一致性為86.02%（圖7）。
3討論與結(jié)論
該研究通過RTPCR和RACE技術(shù)方法，成功克隆了鐵皮石斛RCA2基因（GenBank登錄號(hào)KT205842）全長(zhǎng)1730bp，開放閱讀框1323bp，編碼440個(gè)氨基酸；核苷酸序列分析結(jié)果表明，RCA2核苷酸序列與蝴蝶蘭（Phalaenopsis）的相似性高達(dá)87%，其編碼蛋白屬于PloopNTPaseSuperfamily家族基因。蛋白理化性質(zhì)分析該蛋白的分子質(zhì)量為48.53kDa，等電點(diǎn)為6.19，為親水性蛋白，RCA2編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位于葉綠體基質(zhì)；編碼蛋白質(zhì)的功能包括中間代謝、脂肪酸代謝、翻譯、輔酶因子的生物合成和能量代謝等，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型與RCA2蛋白一致性為86.02%，這些生物學(xué)參數(shù)為進(jìn)一步研究RCA2蛋白的酶學(xué)性質(zhì)及其在鐵皮石斛中的光合作用機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：蓖麻（Riciuns communis L.）；油體固醇蛋白質(zhì)；生物信息學(xué)
中圖分類號(hào)：S565.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）11-2930-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.056
蓖麻（Riciuns communis L.）是大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬（Ricicuns）一年或多年生雙子葉植物，廣泛生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，是世界十大重要油料作物之一[1]。植物種子中有一種儲(chǔ)存營養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)胞器――油體[2-4]，其內(nèi)部主要成分為三酰甘油，外部則為磷脂單分子層及嵌入其內(nèi)的油體結(jié)合蛋白質(zhì)組成的半單位膜[5]。油體結(jié)合蛋白質(zhì)主要有三種――油脂蛋白質(zhì)、油體鈣蛋白質(zhì)和油體固醇蛋白質(zhì)。油脂蛋白質(zhì)由N-和C-末端兩個(gè)親水區(qū)域及中間疏水錨定區(qū)域組成。N-和C-末端暴露在油體表面，能夠提供空間位阻和負(fù)電斥力來維持油體的穩(wěn)定[5]。Chen等[6]在油體中發(fā)現(xiàn)了3種微量蛋白質(zhì)分別稱為Sop1、Sop2、Sop3。Sop1稱為油體鈣蛋白質(zhì)。油體鈣蛋白質(zhì)由N-端親水鈣結(jié)合區(qū)域、C-端親水性磷酸化區(qū)域和中間疏水錨定區(qū)域組成，可能在油體成熟、脂肪動(dòng)員和提高油體穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用[5]。Sop2、Sop3被稱為油體固醇蛋白質(zhì)-A和油體固醇蛋白質(zhì)-B[7]。油體固醇蛋白質(zhì)是一種羥基固醇脫氫酶，屬于SDR家族[8，9]。N-端的疏水區(qū)域由兩個(gè)親性α螺旋夾著一個(gè)疏水錨定結(jié)構(gòu)組成，在此疏水區(qū)域中部有Pro knob結(jié)構(gòu)[10]，其余部位分為NADPH、固醇結(jié)合區(qū)域和兩者之間的活性位點(diǎn)S-（12X）-Y-（3X）-K[10]。Sop3和Sop2蛋白質(zhì)的固醇結(jié)合區(qū)域不同[7]。近來發(fā)現(xiàn)油體蛋白質(zhì)也存在于根尖和芽等胚后組織中，推測(cè)在植物體內(nèi)還存在未被發(fā)現(xiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]。本試驗(yàn)以擬南芥蛋白質(zhì)作“種子”在蓖麻的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索，結(jié)合關(guān)鍵字搜索方法對(duì)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為該蛋白質(zhì)的鑒定提供參考。
1 材料與方法
1.1 蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫搜索
以“Steroid dehydrogenase”為關(guān)鍵字在蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫（http：///search.php）中搜索，下載基因、cDNA和蛋白質(zhì)序列；以6條擬南芥油體固醇蛋白質(zhì)[11]作為“種子”，分別在蓖麻數(shù)據(jù)庫（http：///search.php）中進(jìn)行Blastp搜索，E設(shè)為1×10-30，獲得同源的油體固醇蛋白質(zhì)的基因、cDNA和蛋白質(zhì)序列，去除重復(fù)后，再利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域分析工具（http：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）對(duì)所獲得的蛋白質(zhì)家族進(jìn)行鑒定，檢測(cè)是否有SDR（短鏈脫氫/還原酶超家族）的保守結(jié)構(gòu)域。
1.2 蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析
蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)采用Protparam軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；內(nèi)含子、外顯子組成采用Spidey軟件進(jìn)行分析；疏水性/親水性采用ProtScal軟件進(jìn)行分析；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用GOR4軟件進(jìn)行分析；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域采用TMHMM 2.0 Server軟件；信號(hào)肽結(jié)構(gòu)采用SignalP4.1 Server軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析與同源建模采用CPHmodels軟件和RasMol-Raindy軟件；進(jìn)化樹的構(gòu)建采用軟件ClustalW2軟件和MEGA 4.1軟件，所有軟件使用的都是其默認(rèn)值，部分分析軟件的網(wǎng)址見表1。
2 結(jié)果與分析
2.1 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析
2.1.1 氨基酸序列的理化性質(zhì)分析 通過綜合分析，最終獲得11條完整的蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)基因，見表2。利用在線分析軟件Protparam對(duì)10種油體固醇蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，得到其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的理化性質(zhì)，結(jié)果見表2。大部分蛋白質(zhì)成員外顯子數(shù)為3或6，氨基酸殘基數(shù)為317～352，分子量為35.286 0～39.918 9 kDa，等電點(diǎn)PI為5.35～9.57。不穩(wěn)定系數(shù)表明，有8種成員在植物內(nèi)可能階段性出現(xiàn)。親水性大部分都為正值，大部分成員都為親水蛋白質(zhì)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明，這11個(gè)蛋白質(zhì)不存在信號(hào)肽。由于Slo11蛋白質(zhì)基因不完整，所以后續(xù)分析中只選擇其他10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)。
2.1.2 疏水性/親水性的預(yù)測(cè)和分析 采用ProtScale軟件對(duì)10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1）表明，以Slo1、Slo9為例，1～40區(qū)域有強(qiáng)烈的疏水性，可能為跨膜區(qū)域與油體內(nèi)部疏水的三酰甘油相接合處，其他區(qū)域無明顯規(guī)律。
2.1.3 跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析 利用在線軟件TMHMM 2.0 Server對(duì)10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，圖2結(jié)果表明，除了Slo5蛋白質(zhì)在氨基酸25、200位點(diǎn)各有一個(gè)跨膜區(qū)，其他9個(gè)蛋白質(zhì)（如Slo9）均只在25位點(diǎn)處有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。
關(guān)鍵詞：弓形蟲；SAC1基因；體外擴(kuò)增；生物信息學(xué)分析
中圖分類號(hào)：R382.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847(2007)04-0348-04
弓形蟲(Toxop1asma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可感染包括人類在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物的有核細(xì)胞，正常人感染弓形蟲后，多呈無癥狀帶蟲免疫狀態(tài)，但孕婦感染后，則可致流產(chǎn)、死胎以及胎兒先天畸形，弓形蟲作為一種重要的機(jī)會(huì)性致病原蟲，已成為導(dǎo)致免疫缺陷患者死亡的主要原因之一，sAC1是剛地弓形蟲速殖子主要表面抗原之一，其分子質(zhì)量約為30kD，研究表明3AC1在弓形蟲入侵宿主的過程中發(fā)揮了雙重作用，它不僅在介導(dǎo)弓形蟲速殖子入侵宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮了重要作用，而且還可引發(fā)宿主體內(nèi)強(qiáng)烈的抗原抗體反應(yīng)，此種免疫原性特質(zhì)，使其成為診斷性抗原與免疫性抗原的重要候選基因，本文根據(jù)RH株54C1基因序列參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)寡核苷酸引物，采用PCR技術(shù)從弓形蟲RH株基因組DNA中擴(kuò)增編碼SAC1基因片段，并對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步通過基因工程進(jìn)行表達(dá)做準(zhǔn)備，同時(shí)也為體外研究弓形蟲SAC1基因的結(jié)構(gòu)與功能及其在免疫診斷學(xué)中的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 主要試劑及工具酶
TaqDNA聚合酶(Takara公司)；dNTPs、蛋白酶K(上海生物工程公司)；Tris堿、SDS、EDTA、酚、氯仿均為國產(chǎn)分析純。
1．1．2 蟲株
弓形蟲RH株由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院陳觀今教授惠贈(zèng)。
1．1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SPF級(jí)昆明小鼠，6～8周齡，18～20g，購于廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1．2 方法
1．2．1 引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)GenBank中弓形蟲54C1基因序列(序列號(hào)：S76248)311～1321位，設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1和P2，P1：5'-ATGTCGGTTTCGCTGCACCACTT-3，，P2:5-TACGCGACACAAGCTGCGATAGAGCC-3'，引物由上海生工合成，并經(jīng)PAGE純化。
1．2．2 弓形蟲基因組DNA提取
弓形蟲RH株速殖子復(fù)蘇后，每只0.3m1腹腔接種感染昆明小鼠，3～5d后，脫頸處死小鼠，腹腔注入2m1 PBS，收集腹水，PBS洗滌兩次，離心收集蟲體，加100mmo1/1Tris-C1，5 mmo1/1EDTA，200 mmo1/1 NaC1，1％SDS，100mg/1蛋白酶K，55℃震蕩過夜，然后分別用飽和酚、氯仿／異戊醇各抽提一次，等體積異丙醇沉淀，沉淀溶于100μ1三蒸水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1．2．3 目的基因片段的PCR擴(kuò)增
在0.2m1 Eppendoff管中依次加入下列成份：ddH2O 36.75μ1 10x緩沖液5μ1、dNTP(10mmo1/1)1μ1、正反向引物(20μmo1/1)各1μ1、模版DNA 5μ1，Taq酶0.25μ1，總反應(yīng)體積為50μ1.95℃預(yù)熱10min后，94℃60s，50℃60s，72℃ 120s，行30個(gè)循環(huán)，將PCR產(chǎn)物5tx1在含溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠中電泳，UVP觀察結(jié)果并拍照。
1．2．4 DNA序列測(cè)定
PCR產(chǎn)物由上海英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定。并與GenBank中的基因序列(S76248)進(jìn)行同源性比對(duì)。
1．2．5 克隆序列的生物信息學(xué)分析方法
利用ExPASy中的Trans1ate程序?qū)AC1基因的核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列，通過protparam(us.省略/egi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化參數(shù)，采用NCBI服務(wù)器中的CDD程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行保守功能域分析，判斷該基因是否具有完整的保守結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步推斷對(duì)應(yīng)的核苷酸序列是否具有完整的開放讀碼框，采用InterPro程序(ebi.ac.uk/InterProSean)對(duì)SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，尋找氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域，了解目的序列可能的功能性質(zhì)，利用NPS及Singa1 IP3.0及PSORT服務(wù)器，對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及折疊類型、信號(hào)肽位置、亞細(xì)胞定位及跨膜螺旋域進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)一步了解目的序列的基本特征。
2 結(jié)果
2．1 目的基因擴(kuò)增
從弓形蟲RH株基因組DNA異擴(kuò)增出編碼SAG1表面抗原基因片段，PCR產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，
2．2 SAG1基因序列測(cè)定
以PCR擴(kuò)增的特異引物，從正反兩個(gè)方向進(jìn)行測(cè)序，雙向測(cè)序的結(jié)果相吻合，與GenBank中所給的基因序列(S76248)相比對(duì)，所擴(kuò)增序列位于sAC1基因組DNA序列的311～1321處，共1006個(gè)堿基，包含了SAC1基因開放讀碼框內(nèi)的所有堿基，擴(kuò)增序列的第519位發(fā)生了G-A突 變，但并不影響其編碼的氨基酸序列，ACG及ACA編碼的均為蘇氨酸。
2．3 克隆序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果
2．3．1 54C1基因的氨基酸序列
利用ExPASy中的Trans1ate程序?qū)AG1基因的核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列，可知其編碼336個(gè)氨基酸，結(jié)果如下：
2．3．2 物理化學(xué)特性分析
通過protparam(us.省略/cgi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化參數(shù)，分析結(jié)果表明，34C1分子質(zhì)量為83495.2，理論等電點(diǎn)為5.04，在哺乳動(dòng)物、大腸桿菌、酵母中的半衰期分別為4.4h(體外)、＞20h(體內(nèi))、＞10h(體內(nèi))，不穩(wěn)定指數(shù)為46.93，脂溶性指數(shù)為24.73，兩親性指數(shù)為0.82。
2．3．3 保守結(jié)構(gòu)域搜索
利用NCBI的CDD程序?qū)AG1的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示SAG1有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別位于其氨基酸序列的54～176位及184～300位，這兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)弓形蟲對(duì)宿主細(xì)胞的粘附以及引發(fā)宿主免疫反應(yīng)的過程中起到了重要作用。
2．3．4 氨基酸功能域搜索
采用InterPro程序?qū)WISS-PR07蛋白質(zhì)數(shù)
據(jù)庫進(jìn)行檢索，對(duì)SAG3的氨基酸功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)搜索結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)，推測(cè)SAG3的氨基酸功能域可能位于54～176位與184～301位之間。
2．3．5 二級(jí)結(jié)構(gòu)和折疊類型預(yù)測(cè)結(jié)果
NPS同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)SAG1二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋，β-折疊和不規(guī)則卷曲組成，其中α-螺旋占18.75％，β-折疊占27.71％，無規(guī)則卷曲占59.71％。
2．3．6 信號(hào)肽預(yù)測(cè)
利用Singa1 IP3.0及PSOR了psort.nibb.ac.jp/form.htm1服務(wù)器對(duì)SAG1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其編碼的氨基酸序列的前47個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。
2．3．7 蛋白跨膜螺旋及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)
應(yīng)用PSORT Prediction對(duì)SAG1進(jìn)行跨膜螺旋及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其跨膜域位于第320～336位，為典型的Ia型跨膜蛋白，為GPI錨定蛋白，存在于細(xì)胞膜上的可能性為91％，在溶酶體膜上存在的可能性為20％，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和腔內(nèi)存在的可能性各為10％。
3 討論
自Burg JL對(duì)弓形蟲sA C1的全部基因序列發(fā)表后，國內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)弓形蟲幾個(gè)分離株進(jìn)行PCR克隆、測(cè)序、表達(dá)，國內(nèi)的陳曉光等曾試過在不同的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)SAG1，包括在大腸桿菌中的非融合的pBV220系統(tǒng)和融合的pRSE了系統(tǒng)以及桿狀病毒系統(tǒng)，龔婭等以及陳曉光等分別構(gòu)建了弓形蟲重組質(zhì)粒pET-SAC1，使SAC1在PET系統(tǒng)中表達(dá)，朱翔等構(gòu)建了PGEX-SAC1重組質(zhì)粒，使其在PGEX系統(tǒng)中表達(dá)，我們從弓形蟲RH株的基因組中成功的克隆擴(kuò)增出了SAC1基因序列，經(jīng)測(cè)序證明，僅第519位發(fā)生了G-A突變，且為無意突變，并利用ExPASy中的Trans1ate程序?qū)AC1基因的核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列后，利用生物信息學(xué)軟件分析得出其具有一定的疏水性，具有信號(hào)肽序列，信號(hào)肽剪切位點(diǎn)約位于第47位，為GPI錨定蛋白，跨膜域位于320～336位，為典型的Ia型跨膜蛋白，與國外學(xué)者實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果相符合。
關(guān)鍵詞：玉米（Zea mays L.）；淹水脅迫；誘導(dǎo)表達(dá)；啟動(dòng)子
中圖分類號(hào)：S512.1；Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）23-5880-04
洪澇災(zāi)害給農(nóng)作物造成了很大的損失，僅南亞地區(qū)每年有超過15%的玉米（Zea mays L.）種植面積遭受不同程度的危害[1]。玉米是我國種植面積最大的農(nóng)作物之一[2]，但由于南方地區(qū)季節(jié)性降雨，玉米苗期經(jīng)常遭受綿綿春雨，花期和灌漿期則往往遭遇梅雨，排灌系統(tǒng)不良、低洼地區(qū)的春玉米經(jīng)常遭受洪澇災(zāi)害。我國受洪澇災(zāi)害的農(nóng)田面積平均每年達(dá)956萬hm2，其中嚴(yán)重的年份，受災(zāi)面積達(dá)1 500萬hm2以上[3]。
乙烯反應(yīng)因子（Ethylene response factors，ERF）是乙烯信號(hào)途徑調(diào)控的重要因子，參與植物生物和非生物脅迫的表達(dá)調(diào)控[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)ERF基因參與了水稻（Oryza sative L.）和深水稻的淹水脅迫響應(yīng)。在淹水條件下Sub1A基因可以抑制乙烯的產(chǎn)生，限制葉片和節(jié)間的伸長(zhǎng)，降低葉綠素的降解和碳水化合物的消耗，而使水稻生長(zhǎng)處于“靜止”狀態(tài)，并在退水后能迅速恢復(fù)生長(zhǎng)[7]。Xu等[8]克隆了Sub1A基因，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Sub1A基因?qū)氲讲荒脱退木静牧现?，提高了耐淹水性。Hattori等[9]從深水稻中克隆了2個(gè)ERF基因，分別是SNORKEL1和SNORKEL2。淹水條件下，深水稻體內(nèi)乙烯的積累，誘導(dǎo)了SNORKEL1和SNORKEL2基因的表達(dá)，促進(jìn)了節(jié)間的顯著伸長(zhǎng)，從而使深水稻的莖稈伸出水面，避免遭受溺亡。擬南芥（Arabidopsis thaliana）RAP2.2也是一個(gè)ERF基因，在根部表達(dá)量較高。轉(zhuǎn)基因結(jié)果證實(shí)上調(diào)RAP2.2基因的表達(dá)，提高了擬南芥耐淹水性，相反敲除RAP2.2基因，擬南芥對(duì)淹水非常敏感；同時(shí)，RAP2.2基因上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，其ADH1和PDC酶的活性較高[10]。
以上研究表明，ERF基因參與了水稻、深水稻和擬南芥的淹水脅迫響應(yīng)，是耐淹澇的關(guān)鍵基因。課題組使用生物信息學(xué)方法，從玉米基因組中獲得了107個(gè)ERF基因，并使用RNA-seq技術(shù)，分析了這些基因在玉米自交系Hz32（耐漬系）根系不同淹水條件下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ZmERF2基因受淹水脅迫誘導(dǎo)表達(dá)（待發(fā)表）。本研究分別從玉米自交系Hz32和Mo17（敏感系）中克隆出了ZmERF2基因的啟動(dòng)子，并對(duì)該啟動(dòng)子進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，將有助于進(jìn)一步揭示玉米耐漬性形成的分子機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 材料
耐漬性較強(qiáng)的玉米自交系Hz32和耐漬性較弱的玉米自交系Mo17，均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張祖新教授惠贈(zèng)。
1.2 方法
1.2.1 玉米基因組DNA的提取 利用改進(jìn)的CTAB法[11]分別提取玉米自交系Hz32和Mo17的基因組DNA。
1.2.2 玉米根系總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 玉米自交系Mo17、Hz32于三葉一心期，分別進(jìn)行0、4 h的淹水處理。使用植物總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），分別提取各處理根系的總RNA。將各處理的總RNA作為模板，使用cDNA第一鏈合成試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），分別合成cDNA第一鏈。
1.2.3 PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)玉米自交系B73 ZmERF5基因序列，分別設(shè)計(jì)用于RT-PCR和PCR擴(kuò)增的引物，引物序列見表1。引物GSP1-F、GSP1-R用于RT-PCR，分析不同淹水處理ZmERF5基因在Mo17、Hz32根系的表達(dá)情況。引物GSP2-F、GSP2-R用于PCR擴(kuò)增ZmERF5基因啟動(dòng)子。
1.2.4 ZmERF5基因表達(dá)的RT-PCR分析 分別提取淹水0、4 h處理的Mo17、Hz32根系總RNA，并分別合成cDNA第一鏈。將合成的cDNA第一鏈作為模板，進(jìn)行RT-PCR分析。RT-PCR擴(kuò)增體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取8.0 μL RT-PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并于凝膠成像系統(tǒng)拍照、保存。
1.2.5 ZmERF5基因啟動(dòng)子的克隆 分別以Mo17、Hz32的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）0.2 μL，50 ng/μL DNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性60 s，63 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析。
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【摘要】 目的 在大腸桿菌中表達(dá)人神經(jīng)肽Y Y2受體，并對(duì)之進(jìn)行純化、鑒定及生物信息學(xué)分析。方法 取已構(gòu)建好且經(jīng)測(cè)序確認(rèn)無誤的重組質(zhì)粒pET28aY2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，并經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)和Western 印跡鑒定，表達(dá)產(chǎn)物包涵體經(jīng)Ni2+NTA親和層析純化。然后利用相關(guān)在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析Y2受體蛋白。結(jié)果 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)含有pET28aY2重組質(zhì)粒的DE3菌，表達(dá)出重組人Y2融合蛋白。重組蛋白經(jīng)Ni2+NTA親和層析進(jìn)行純化后，得到了較高純度的融合蛋白。經(jīng)相關(guān)在線軟件分析后獲得了Y2受體的相關(guān)生物學(xué)特性。結(jié)論 重組質(zhì)粒pET28aY2在大腸桿菌DE3中成功表達(dá)，親和層析純化后獲得較高純度融合蛋白，并對(duì)Y2受體蛋白的生物學(xué)特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能及其抗體的研制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】 人神經(jīng)肽Y Y2受體;融合蛋白;包涵體;純化;生物信息學(xué)
【Abstract】 Objective To express human Y2 receptor protein in E. coli，purify and identify it，and conduct bioinformatic analysis of Y2 receptor protein. Methods The recombinant plasmid pET28aY2 which had been well constructed and sequentially confirmed was transplanted into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG to express fusion proteins. SDSPAGE and Western blot were used to test and identify the expressed fusion proteins. The inclusion body of the expressed product was purified by Ni2+NTA affinity chromatography. Then bioinformatic analysis of the Y2 receptor was conducted with the help of related online software. Results After being induced by IPTG，the DE3 with recombinant plasmid pET28aY2 expressed recombinant human Y2 receptor protein. Highly purified fusion protein was obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Related biological characteristics of Y2 receptor were obtained after the online software analysis. Conclusions The recombinant plasmid pET28aY2 can be successfully expressed in DE3. Highly purified proteins can be obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Y2 receptor′s biological characteristics are predicted， which lays foundation for further studies of Y2 receptor protein′s biological function and antibody development.
【Key words】 NeuropeptideY Y2 receptor; Fusion protein; Inclusion body; Purification; Bioinformatics
神經(jīng)肽Y(NPY)是由36個(gè)氨基酸組成的多肽，屬于胰多肽家族，作為一個(gè)信號(hào)分子在不同物種間有高度的保守性。人體內(nèi)NPY相關(guān)的受體主要存在于中樞神經(jīng)組織中，此外在外周組織也有分布。其中與脂肪組織相關(guān)的受體主要有Y1、Y2和Y5〔1，2〕。NPY通過與其受體Y2(NPY2R)的作用刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化，在血管生成過程中重要的作用〔3，4〕，Kuo等〔1〕的研究表明NPY在脂肪重塑、飲食誘導(dǎo)的肥胖加劇及伴隨的代謝綜合征形成中有重要的作用。他們認(rèn)為，NPY與NPY2R相互作用，通過血管生成引起內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的增殖、分化，表明NPY及NPY2R可作為媒介用以增加移植脂肪組織的體積和存活。
1 材料與方法
1.1 材料 E.coli BL21(DE3)、含有測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28aY2的保存菌均由本室保存;蛋白Marker購自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 均購于天根生化科技有限公司;鎳離子親和層析預(yù)裝柱及化學(xué)發(fā)光顯色試劑購于QIAGEN公司;蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)移儀(BioRad公司);cientzIID超聲細(xì)胞粉碎機(jī)為寧波新芝科器研究所產(chǎn)品;其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 方法
1.2.1 重組人NPY2R融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 用接種環(huán)沾取少量含有重組質(zhì)粒pET28aY2的保存菌，于LB(Kan+)平板上劃線，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落，接種于5 ml LB (Kan+ )液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)過夜。次日取培養(yǎng)過夜菌液500 μl 再接種于50 ml選擇性LB 液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.6。吸取1 ml后加入IPTG，終濃度為1 mmol/L，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。取加IPTG前和后的菌液各1 ml，12 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，并于沉淀中加50 μl蒸餾水，混勻后再加2×SDSPAGE上樣緩沖液50 μl，混勻，沸水浴5 min，12 000 r/min離心10 min，每個(gè)樣品取20 μl上樣于10%的SDSPAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后取考馬斯亮蘭R250染色2 h，然后脫色，拍照記錄結(jié)果。
1.2.2 包涵體的釋放 據(jù)上所述，在2 000 ml的搖瓶中裝500 ml的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大誘導(dǎo)規(guī)模。將誘導(dǎo)表達(dá)菌液，4℃，5 000 r/min，離心15 min，收集菌體沉淀;加入25 mlPBS，吹打充分懸浮菌體沉淀，4℃，12 000 r/min，離心30 min，棄去上清，依此反復(fù)沖洗菌體沉淀3次;加入細(xì)胞裂解液25 ml，吹打使菌體沉淀均勻懸浮;將菌體沉淀懸浮液置-20℃冷凍，再于室溫融化，如此反復(fù)凍融3次;4℃，12 000 r/min，離心細(xì)菌凍融液30 min，棄去上清，在沉淀中加入超聲裂解液25 ml，吹打混勻;置冰上對(duì)細(xì)菌凍融液進(jìn)行超聲處理，10 min/次，處理時(shí)間30 min;超聲處理后，于4℃，12 000 r/min，離心30 min，棄去上清，沉淀為菌細(xì)胞裂解沉淀物。
1.2.3 包涵體的提純 于菌細(xì)胞裂解沉淀物中加入含4 mol/L尿素的包涵體提純液25 ml，吹打混勻，室溫靜置30 min，12 000 r/min離心30 min，反復(fù)3次，即得到包涵體沉淀物。
1.2.4 包涵體的裂解 于包涵體沉淀物中加入包涵體裂解液25 ml，吹打混勻，室溫靜置6 h，使包涵體充分裂解，2 000 r/min離心30 min，收集上清液，即為包涵體裂解物。
1.2.5 變性蛋白的復(fù)性 將收集的包涵體裂解物上清液加入到處理過的透析袋中，扎緊透析袋兩端;將透析袋整體浸沒于蛋白復(fù)性液，在4℃條件下透析;復(fù)性液中的尿素濃度從7～1 mol/L依次遞減，在每個(gè)尿素濃度梯度復(fù)性液中透析3～4 h。每次更換不同尿素濃度復(fù)性液之前，需要將透析袋內(nèi)的樣品吸出，4℃，12 000 r/min，離心30 min，再把上清液加入透析袋內(nèi)，重新扎緊進(jìn)行透析;透析完畢后，將樣品取出，4℃，12 000 r/min，離心30 min，再將上清液加入透析袋，在4℃預(yù)冷的PBS中透析20 h;取出透析好的樣品，4℃，12 000 r/min，離心30 min，收集上清液即為復(fù)性產(chǎn)物。-70℃保存。
1.2.6 復(fù)性產(chǎn)物的純化 ①上樣：將復(fù)性產(chǎn)物緩慢加于已用PBS緩沖液平衡的鎳離子親和層析預(yù)裝柱中，加樣所用的流速要控制在1 ml/min以內(nèi);②沖洗：PBS洗滌除去未結(jié)合蛋白，沖洗流速應(yīng)控制在5 ml/min以內(nèi);③洗脫：分別用含50、100、150 mmol/L咪唑PBS緩沖液洗脫融合蛋白，流速5 ml/min。
1.2.7 純化產(chǎn)物Western印跡檢測(cè) 取純化后產(chǎn)物20 μl上樣于10%的分離膠SDSPAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行Western印跡分析。一抗為鼠抗人Anti6×His(1∶1 000稀釋)，二抗為辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG抗體(1∶5 000稀釋)，采用化學(xué)發(fā)光法顯影，于X光片上曝光。
1.2.8 生物信息學(xué) 對(duì)所表達(dá)的NPY2R融合蛋白分別利用在線軟件(expasy.org/tools/protparam.html)進(jìn)行氨基酸組成及理化性質(zhì)分析;利用在線軟件(ca.expasy.org/tools/protscale.html)進(jìn)行疏水性分析;利用在線軟件(ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進(jìn)行跨膜分析;利用在線軟件(cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析;利用在線軟件(npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);利用在線軟件(swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1)對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);最后利用Harvard大學(xué)的在線生物信息學(xué)軟件(bio.dfci.harvard.edu/Tools /antigenic.html) 進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)。
2 結(jié) 果
2.1 誘導(dǎo)pET28aY2表達(dá)NPY2R結(jié)果 pET28aY2表達(dá)的NPY2R在N端有非NPY2R的36個(gè)氨基酸的融合蛋白，其中有6個(gè)組氨酸的tag(Histag)，目的蛋白NPY2R由381個(gè)氨基酸組成，即pET28a2Y表達(dá)的完整融合蛋白由417個(gè)氨基酸組成，分子量約47 kD。見圖1。
2.2 融合蛋白純化后的鑒定 NPY2R蛋白在含150 mmol/L咪唑PBS緩沖液可以完全被洗脫，分別進(jìn)行10%的SDSPAGE電泳鑒定，見圖2。
2.3 純化蛋白的Western印跡結(jié)果 用化學(xué)發(fā)光法顯影，X光片曝光后可見一清晰條帶，表明目的蛋白得到有效表達(dá)和純化，見圖3。
2.4 NPY2R的生物信息學(xué)分析
2.4.1 氨基酸組成及理化性質(zhì)分析 利用expasy.ch中的Expasy protparam tool對(duì)NPY2R的理化參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)編碼區(qū)編碼的氨基酸數(shù)目為417個(gè)。堿性氨基酸總數(shù)(Arg+Lys=35)等于酸性氨基酸總數(shù)(Asp+Glu=35) 。預(yù)測(cè)相對(duì)分子量為46.55 kD，等電點(diǎn)pI為7.27。其半衰期在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞為30 h，在酵母體內(nèi)大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10 h。不穩(wěn)定系數(shù)為31.63，歸類為穩(wěn)定蛋白(當(dāng)一個(gè)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)>40時(shí)，則該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定)。
2.4.2 疏水性分析 蛋白質(zhì)分子的基本特性之一是親水的極性部分在分子的表面，疏水的非極性部分在分子內(nèi)部。因此，根據(jù)每種殘基的極性和氨基酸序列就能較容易地了解到一級(jí)結(jié)構(gòu)中不同肽段的極性，從而估測(cè)出不同肽段在分子內(nèi)外的定位。用Expasy軟件估測(cè)了NPY2R極性，結(jié)果見圖4。橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)氨基酸殘基的序號(hào)，縱坐標(biāo)表示殘基的疏水親水的特性;正值為疏水，負(fù)值為親水。從圖中可以看出，NPY2R具有較強(qiáng)的疏水性，位于分子的內(nèi)部。
圖4 NPY2R的疏水性分析
2.4.3 跨膜性分析 膜蛋白主要有兩大類:內(nèi)膜蛋白和外膜蛋白，內(nèi)膜蛋白與細(xì)胞膜結(jié)合的主要方式是肽段直接跨過細(xì)胞膜，即跨膜蛋白，另外還可以通過脂肪基與細(xì)胞膜發(fā)生共價(jià)結(jié)合，蛋白可在胞內(nèi)，也可在胞外?？缒さ鞍自诩?xì)胞中常以離子通道形式存在，執(zhí)行信號(hào)傳導(dǎo)或物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能。利用在線軟預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)(如圖5示，X軸為氨基酸系列位置，Y軸為氨基酸平均疏水指標(biāo))。
圖5 NPY2R的跨膜性分析
2.4.4 信號(hào)肽分析 將NPY2R蛋白序列提交到在線軟件分析NPY2R是否有信號(hào)肽存在，輸出結(jié)果見圖6，NPY2R蛋白N端1～70位氨基酸序列中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，Y平均值較低，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列存在。因此，推測(cè)NPY2R不存在信號(hào)肽，該蛋白不是分泌蛋白。
圖6 NPY2R的信號(hào)肽分析
2.4.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 預(yù)測(cè)結(jié)果見圖7，表明NPY2R蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由49.40%的α螺旋、13.43%的延伸鏈、37.17%的無規(guī)卷曲組成。
圖7 NPY2R的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
2.4.6 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析，對(duì)理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性有著極其重要的意義。將NPY2R的氨基酸序列提交給SWISSMODEL三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)器，未能生成預(yù)測(cè)的結(jié)果。
2.4.7 抗原性分析 利用在線軟件對(duì)NPY2R的抗原性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖8，有10個(gè)抗原決定簇可供選擇，以便進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
圖8 NPY2R的抗原性分析
3 討 論
NPY2R缺失小鼠能夠明顯減少攝食、降低脂肪沉積和減輕體重〔5〕，在大鼠和小鼠外周注射NPY2R 抑制劑PYY3236 均可抑制攝食，降低體重，而在NPY2R 缺失模型鼠中卻無此作用〔6〕。這表明NPY2R與攝食和肥胖密切相關(guān)。為了探明是否NPYNPY2R信號(hào)系統(tǒng)能剌激體內(nèi)脂肪量的增加，研究者使用遺傳性的肥胖鼠B6.VLepob/J，這種鼠具有能進(jìn)行中樞性的調(diào)節(jié)攝食過量、削弱新陳代謝及減少交感性嗜鉻細(xì)胞活性的特點(diǎn)。與對(duì)照組鼠相比，這些鼠血清NPY水平高出正常值的200%，并且明顯地上調(diào)腹部皮下脂肪的NPY及其受體Y2的表達(dá)。這也支持了一種觀點(diǎn)，即循環(huán)的NPY來源于脂肪組織。利用腹部皮下脂肪源性的NPY進(jìn)行處理后，可觀察到在肥胖及消瘦鼠體內(nèi)脂肪組織的質(zhì)量及體積增加了50%。而相反的是，注射NPY Y2受體拮抗劑可降低肥胖及消瘦鼠體內(nèi)脂肪量及體積的50%。
Baker 等〔7〕研究表明NPY與Y2受體作用可引起機(jī)體內(nèi)新的脂肪生成，并可減少機(jī)體對(duì)移植脂肪的吸收。他們以鼠及猴為對(duì)象進(jìn)行的研究表明將包有NPY并能穩(wěn)定釋放14 d的緩釋藥片植入到鼠的皮下組織中，在藥片植入的周圍會(huì)有新的脂肪生成，而且這種脂肪能夠至少維持3個(gè)月。同時(shí)將含有NPY的藥片植入到兩只猴子腹部的皮下組織中，NPY的用量與給鼠的用量一樣，但1個(gè)月后通過MRI檢測(cè)，同樣可以觀察到脂肪細(xì)胞的生成。
本課題組在完成重組人源化NPY2R基因克隆及序列分析〔8〕的基礎(chǔ)上，將NPY2R基因與pET28α載體連接后表達(dá)于DE3中。pET28α表達(dá)載體在N端含有HisTag寡聚組氨酸鏈，因此，表達(dá)出的融合蛋白在多種情況下都可以便利地和經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行純化。本課題組設(shè)計(jì)的NPY2R融合蛋白N端為36個(gè)氨基酸組成的非目的蛋白，其中包含一個(gè)Histag，其后的目的NPY2R蛋白有381個(gè)氨基酸。即pET28aNPY2R表達(dá)的融合蛋白共由417個(gè)氨基酸組成，分子量約50 kD左右。用6×histag抗體進(jìn)行western 印跡鑒定，表明有大量融合蛋白產(chǎn)生。其分子量與NPY2R融合蛋白相符。目前已完成包涵體的裂解、復(fù)性及純化，其生物學(xué)活性還有待測(cè)定。此外，本課題組利用生物信息學(xué)軟件對(duì)天然NPY2R在一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等多方面進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，并對(duì)其生物學(xué)性狀有了進(jìn)一步的了解，為今后以NPY2R為對(duì)象進(jìn)行的研究準(zhǔn)備了物質(zhì)及理論基礎(chǔ)。但是，對(duì)于NPY2R融合蛋白的生物信息學(xué)分析尚待進(jìn)一步研究。
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[關(guān)鍵詞] 同位單核苷酸多態(tài)；人表皮生長(zhǎng)因子前體蛋白；非同位單核苷酸多態(tài)；生物信息學(xué)
[中圖分類號(hào)] R786 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）01（a）-0014-05
人表皮生長(zhǎng)因子前體蛋白（prepro-epidermal growth factor，preproEGF）mRNA/cDNA序列由24個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)約5 kb，編碼一條1207個(gè)氨基酸的蛋白多肽鏈，該肽鏈在翻譯生成后經(jīng)蛋白酶剪切加工形成的成熟表皮生長(zhǎng)因子（一段53個(gè)氨基酸多肽）對(duì)人體表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和代謝起著十分重要的作用[1]。也許由于mRNA序列轉(zhuǎn)錄的選擇性剪接加工等生物學(xué)機(jī)制的緣故，基因在表達(dá)時(shí)常常會(huì)出現(xiàn)蛋白多肽變體，目前已知的preproEGF變體有腎源和其他組織源兩類。另一方面，preproEGF基因序列的遺傳多態(tài)，特別是單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphysims，SNPs）也可致其出現(xiàn)變體或功能改變，還可引起疾病的發(fā)生[2-3]，例如，迄今的研究已表明，分布在preproEGF基因第61 bp位點(diǎn)的SNP（A/G）與歐美人某些腫瘤例如黑色素瘤等發(fā)生具有相關(guān)性[4]。可見深入探明SNPs及其在preproEGF基因或mRNA/cDNA中的分布情況對(duì)于探索疾病相關(guān)性的研究頗具指導(dǎo)價(jià)值和醫(yī)學(xué)意義。至目前為止，SNPs在preproEGF基因組DNA序列內(nèi)之生物信息學(xué)分布及其在第20、21外顯子和其間內(nèi)含子區(qū)段中呈現(xiàn)稀疏分布的特點(diǎn)于近期已見報(bào)道[5-6]，但其在mRNA/cDNA序列中的情況如何則尚待探明。本研究擬借助NCBI的生物信息學(xué)平臺(tái)對(duì)SNPs及其在preproEGF核酸或mRNA/cDNA序列中的分布進(jìn)行分析定位和標(biāo)注圖解，為進(jìn)一步的疾病相關(guān)性研究和醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
1 對(duì)象與方法
1.1 研究對(duì)象
人preproEGF基因和蛋白多肽及其變體的mRNA/cDNA序列。
1.2 儀器和信息資源
計(jì)算機(jī)（聯(lián)想公司）、電訊寬帶網(wǎng)路（中國電訊）、NCBI的生物信息程序和dbSNP。
1.3 方法
從電訊寬帶登錄網(wǎng)址nlm.nih.gov，參照研究介紹的方法檢索分析和定位注釋存在于preproEGF多肽及其變體mRNA/cDNA序列中的SNPs[7-9]。
2 結(jié)果
經(jīng)Blast和Entrez SNP檢索到在人4號(hào)染色體上分兩類preproEGF多肽的mRNA/cDNA序列中存在有不同數(shù)目和種類的SNPs，可依其rs#從5'端到3'端行順序編號(hào)并歸位其在核酸序列中的位點(diǎn)，同時(shí)計(jì)算各相鄰SNP位點(diǎn)之間的距離。見表1、2。
由表1、2可見，編號(hào)于人兩類preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中的SNPs在種類數(shù)目上有所不同，即腎源類SNPs為51個(gè)，而其他組織源類卻為55個(gè)，總計(jì)106個(gè)SNPs。進(jìn)一步觀察對(duì)比這兩類SNPs可見，其大多數(shù)（84個(gè)或42對(duì)）是位點(diǎn)及種類皆同一或同位的，主要分布在外顯子序列中；而少數(shù)（腎源類9個(gè)，其他組織源類13個(gè)）卻表現(xiàn)出非同位或各自不相同的，主要分布在3'端非編碼序列中。合并表1和表2的資料信息，可繪制成SNPs及其在兩類preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中的分布圖。見圖1（封三）。
由圖1（封三）可見，在第1～5、10、13～15、20～21和第24外顯子中總計(jì)分布有30對(duì)同位點(diǎn)SNPs；在第9外顯子中分布有1個(gè)腎源類非同位點(diǎn)SNP；在第6～8、11～12、16～19和22～23外顯子中沒有SNP分布；7個(gè)腎源類非同位點(diǎn)SNPs或12個(gè)其他組織源類非同位點(diǎn)SNPs分別分布在其3'端非編碼序列中。
3 討論
本研究應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)存在于人preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中的SNP及其分布情況進(jìn)行了檢索分析，結(jié)果得到共計(jì)106個(gè)位點(diǎn)及其SNPs分別分布于兩類（腎源和其他組織源）mRNA/cDNA序列中。深入對(duì)比觀察這些結(jié)果首先可見，分布于兩類序列的42對(duì)共計(jì)84個(gè)SNPs因其相鄰SNP間距相等而初步顯示彼此的SNP位點(diǎn)及種類（RefSNP和亞SNP）皆具同一性；如果對(duì)比分析表1、2中的SNP位點(diǎn)也不難發(fā)現(xiàn)42對(duì)SNPs在兩類mRNA/cDNA序列間之位點(diǎn)差距皆為16 bp，這說明分布于兩類序列中的這些SNPs確實(shí)是位點(diǎn)及種類相同或同一的，本文將其簡(jiǎn)稱為同位SNP。其次，觀察分析結(jié)果也可見表1、2中有22個(gè)SNPs因其相鄰SNP間距既不相等也不遵循兩序列間相應(yīng)位點(diǎn)之差距為16 bp的規(guī)律并且還數(shù)目不等地分別分布于各自歸位的mRNA/cDNA序列中而表現(xiàn)出各自不同的位點(diǎn)差異性，對(duì)此本文稱其為非同位SNP。
觀察圖1（封三）可見，分布在mRNA/cDNA序列編碼區(qū)的SNPs絕大多數(shù)（97%）都是同位SNP對(duì)，這可能是為了維穩(wěn)兩類preproEGF多肽的遺傳需要所決定的，因?yàn)橐揽客籗NPs彼此間的高度同一性，方可確保由這些SNPs組成的密碼子在分別編碼兩條蛋白多肽鏈時(shí)不會(huì)引起相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸（AA）彼此出現(xiàn)差異從而改變蛋白多肽之結(jié)構(gòu)和功能。然而，分布在序列編碼區(qū)的個(gè)別SNP也有不是同位SNP的例外情況，例如，第9外顯子內(nèi)的015號(hào)SNP（R-1816）即不是同位SNP，而是一個(gè)屬于腎源類的非同位SNP 。由于這個(gè)非同位SNP是位于蛋白多肽編碼區(qū)內(nèi)，因而頗有可能令其編碼的AA有別于其他組織源preproEGF多肽序列相應(yīng)位點(diǎn)的AA。一方面造成腎源類preproEGF多肽在結(jié)構(gòu)或生物學(xué)特性方面有別于其他組織源類preproEGF多肽；另一方面因?yàn)樵斐傻鞍锥嚯牡慕Y(jié)構(gòu)和功能改變而導(dǎo)致疾病發(fā)生。盡管有如此可能的風(fēng)險(xiǎn)，但由于這個(gè)非同位SNP所歸位的第9外顯子并不參與編碼53個(gè)AA多肽的成熟EGF，因而不太可能對(duì)成熟EGF的結(jié)構(gòu)和生物活性造成影響或帶來改變。不過，由于第9外顯子參與編碼一段類似EGF的同源多肽和一段低密度脂蛋白（LDL）受體同源肽段，因而這個(gè)非同位SNP還是有可能影響到腎源類preproEGF多肽與其他組織源類preproEGF多肽出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性差異的[1，10]。當(dāng)然事實(shí)是否果真如此迄今仍缺乏直接的證據(jù)，不過已有相似的例子見于研究報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)，位于腎源類preproEGF多肽mRNA/cDNA序列第22外顯子中的一個(gè)單核苷酸由C變成了T，也即C3209T，因而使得preproEGF多肽鏈第1070位AA也相應(yīng)地從脯氨酸變成了亮AA，即P1070L；同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)由于這個(gè)AA的改變導(dǎo)致了腎源preproEGF多肽維持體內(nèi)Mg2+平衡之生物學(xué)功能隨之改變進(jìn)而引發(fā)了低Mg2+血癥[11]。此外，也有報(bào)道觀察到：腎源preproEGF多肽加工生成成熟EGF的場(chǎng)所是位于細(xì)胞之外，而其他組織源（例如下頜下腺、胰腺、前列腺等組織）的preproEGF加工生成成熟EGF則是在細(xì)胞內(nèi)完成的；反之，在頜下腺、胰腺和乳腺等組織，preproEGF可被剪切加工生成成熟的EGF，但是在腎臟，preproEGF則不被剪切加工生成EGF[1]。據(jù)此推測(cè)，兩類preproEGF多肽之間所展示的這些生物學(xué)特性差異也許會(huì)有一些SNP的影響因素在里面。其次，觀察圖1（封三）也可見分布在mRNA/cDNA序列非編碼區(qū)的SNPs大多不是同位而是非同位SNPs。然而，一個(gè)有趣的現(xiàn)象是這些非同位SNPs極少分布在序列5'端非編碼區(qū)，而是大多集中分布在了3' 端非編碼區(qū)，具體的分布情況是：在兩類mRNA/cDNA序列之5'端非編碼區(qū)可見腎源類或其他組織源類SNPs各自僅分布了1個(gè)非同位SNP；而在序列之3'端非編碼區(qū)腎源類SNPs卻集中分布有7個(gè)非同位SNPs，其他組織源類更是集中分布了12個(gè)非同位SNPs。至于這些非同位SNPs的集中分布對(duì)preproEGF多肽有何生物學(xué)意義目前還不十分清楚，不過如果依據(jù)DNA元素百科全書研究項(xiàng)目對(duì)非編碼核酸序列之生物學(xué)功能的發(fā)現(xiàn)和理解并且結(jié)合這些非同位SNPs集中分布于3'端非編碼區(qū)的具體情況考慮，推測(cè)這些非同位SNPs集中分布于3'端非編碼區(qū)可能有利于調(diào)節(jié)preproEGF的組織特異性表達(dá)，也即可能與preproEGF的表達(dá)調(diào)控有關(guān)[12]。
與在基因組序列的分布相比較，SNPs在preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中之分布顯示出較為明確的差異和不甚清晰的相似之處。首先，差異表現(xiàn)在SNPs的種類和數(shù)量方面。具體地說，也即分布于preproEGF基因組序列的SNPs包含有近35%的亞SNPs和65%的RefSNPs；而在兩類mRNA/cDNA序列內(nèi)，其所包含的亞SNPs卻很少（僅占比SNPs約8%），絕大多數(shù)為RefSNPs（占比SNPs約92%）。其次，粗看表1、2結(jié)果感覺SNPs在mRNA/cDNA序列中的分布雜亂無章而與其在基因組序列中的分布規(guī)律毫無共通之處，然而細(xì)致觀察卻可見到SNPs在這兩種序列中的分布仍有些許相似之處，具體表現(xiàn)在：①如果以200 bp相鄰SNP間距劃線為界即可見有少數(shù)SNPs（相鄰間距>200 bp）是呈不均等散布于mRNA/cDNA序列中的；②SNPs在1～24外顯子區(qū)段呈現(xiàn)出以外顯子6～8、11～12、16～19和22～23為間隔而集合分布在第1～5、10、13～15、20～21和第24外顯子中的特征也與其在基因組序列中呈富集叢簇分布的特征頗為相似[5]。此外，總觀圖1（封三）的SNPs分布還可見其在mRNA/cDNA序列中有一個(gè)從5'端往3'端逐漸密集分布以至緊密排列的特征，不過其生物學(xué)意義尚待研究。
合并表1、2所列資信繪制而成的SNPs分布圖令其在兩類preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中之分布情形顯得較為直觀簡(jiǎn)明，易于理解，可為SNP與疾病的相關(guān)性研究提供便捷之信息支撐，對(duì)其他醫(yī)學(xué)應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究也具有參考價(jià)值。
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關(guān)鍵詞：生物信息學(xué)；教材；師范院校
20世紀(jì)80年代末以來，生物信息學(xué)以驚人的發(fā)展速度，獲得了很多突破性成就，正日益成為生命科學(xué)在21世紀(jì)發(fā)展的核心內(nèi)容。對(duì)于未來生物科學(xué)中堅(jiān)力量的現(xiàn)代生物科學(xué)工作者而言，掌握生物信息學(xué)的相關(guān)知識(shí)尤為重要。
作為一門新興的課程，生物信息學(xué)課程在全國很多高等院校都已經(jīng)開設(shè)，并進(jìn)行了一些卓有成效的探索和改革。我們結(jié)合自身的教學(xué)實(shí)踐和相關(guān)學(xué)校的教學(xué)現(xiàn)狀，對(duì)師范院校生物信息學(xué)課程教學(xué)內(nèi)容、師資力量、教學(xué)模式和方法、跨學(xué)科合作、教學(xué)實(shí)踐實(shí)施情況等方面的現(xiàn)狀進(jìn)行了積極分析和思考。目前，師范院校生物信息學(xué)教學(xué)的現(xiàn)狀如下。
一、教學(xué)內(nèi)容陳舊、教學(xué)資源缺乏
生物信息學(xué)是一門新興的學(xué)科，在高等院校開設(shè)時(shí)間較晚，我國對(duì)生物信息學(xué)專業(yè)精品課程的建設(shè)方面投入不夠，成熟的生物信息學(xué)教學(xué)大綱、教案、多媒體課件、教學(xué)視頻和習(xí)題等教學(xué)資源稀少。目前，市場(chǎng)上也缺乏相關(guān)的生物信息學(xué)教學(xué)多媒體課件和音像制品輔導(dǎo)材料等相關(guān)產(chǎn)品，造成生物信息學(xué)教學(xué)資源匱乏的現(xiàn)狀。
目前師范院校所用教材大多數(shù)是徐程主編的《生物信息與數(shù)據(jù)處理》，蔣彥等編著的《基礎(chǔ)生物信息學(xué)及應(yīng)用》等幾種不同版本的教材。這些教材在知識(shí)性、科學(xué)性和系統(tǒng)性方面還行，但是在教學(xué)內(nèi)容的新穎性、時(shí)效性和實(shí)踐性以及生物相關(guān)背景的介紹和對(duì)師范院校的適用性等方面有所欠缺。生物信息學(xué)的知識(shí)日新月異，新的數(shù)據(jù)庫、新的軟件、新的算法層出不窮，而生物信息學(xué)的課堂往往不能及時(shí)地將最新進(jìn)展呈現(xiàn)給學(xué)生，導(dǎo)致課堂內(nèi)容陳舊，不利于學(xué)生的發(fā)展和對(duì)生物信息知識(shí)的合理掌握，從而影響了生物信息學(xué)教學(xué)的質(zhì)量。
二、師資力量缺乏
生物信息學(xué)是一門新興的交叉學(xué)科，需要熟練掌握計(jì)算機(jī)與生物學(xué)知識(shí)的老師來授課。然而，實(shí)際上，由于缺少生物信息學(xué)的專業(yè)教師，教授該學(xué)科的教師多為生物學(xué)其他課程兼任，這些老師往往缺乏專門的生物信息學(xué)訓(xùn)練，在知識(shí)的傳授和應(yīng)用方面存在欠缺。與生物信息學(xué)教學(xué)要求存在著較大的差距，不能很好地滿足教學(xué)大綱的要求。另外，師范院校通常將生物信息學(xué)作為選修課來開設(shè)，該課程在專業(yè)建設(shè)和人才培養(yǎng)方案中的地位偏低，造成相關(guān)部門對(duì)師資培養(yǎng)不夠重視。
三、教學(xué)模式和方法落后
由于生物信息學(xué)課程涉及大量的數(shù)據(jù)庫和軟件知識(shí)，教師普遍采用多媒體教學(xué)。而多媒體課件的容量通常很大，學(xué)生忙于筆記，難以把握重難點(diǎn)。同時(shí)，幻燈片展示的知識(shí)點(diǎn)猶如放電影一般一閃而過，學(xué)生沒有足夠的時(shí)間思考和消化，跟不上教師的進(jìn)度。教師進(jìn)行多媒體教學(xué)時(shí)，往往是一堂課上從頭講到尾，語調(diào)缺乏抑揚(yáng)頓挫，沒有起伏，學(xué)生很容易昏昏欲睡。因此，教師雖然使用的是先進(jìn)的教學(xué)工具，采用模式的卻是傳統(tǒng)的灌輸式教學(xué)，只管埋頭照本宣科，不管學(xué)生接收領(lǐng)悟多少。學(xué)生為了達(dá)到期末考試標(biāo)準(zhǔn)，只顧死記硬背，這樣的教育讓學(xué)生失去創(chuàng)新精神和主動(dòng)思考的能力，失去對(duì)生物信息課程的興趣。
四、缺乏與相關(guān)學(xué)科的合作交流
生物信息學(xué)實(shí)際上是生物學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)的交叉學(xué)科。然而一般高校往往只在生命科學(xué)學(xué)院開設(shè)生物信息學(xué)，由生物學(xué)老師來擔(dān)任授課老師。由于對(duì)計(jì)算機(jī)科學(xué)知識(shí)的缺乏，導(dǎo)致生物專業(yè)教師對(duì)生物信息學(xué)課程很難深入開展；另一方面，計(jì)算機(jī)科學(xué)專業(yè)由于沒有開設(shè)生物信息學(xué)課程，使學(xué)生不能了解到生物信息學(xué)的重要性，以及如何使計(jì)算機(jī)科學(xué)更快更好地發(fā)揮其在生物信息學(xué)中的作用?？偟膩碚f，生物信息學(xué)課程的建設(shè)欠缺相關(guān)學(xué)科的協(xié)作，不能有效地整合資源，不利于培養(yǎng)復(fù)合型人才。
五、缺乏實(shí)踐教學(xué)內(nèi)容
現(xiàn)有的生物信息學(xué)課程也有一些實(shí)踐內(nèi)容，但實(shí)踐課時(shí)數(shù)少，內(nèi)容相對(duì)簡(jiǎn)單，缺乏系統(tǒng)完善的實(shí)踐過程。教師為學(xué)生講授具體知識(shí)時(shí)，通常只通過多媒體課件演示操作，并沒有為學(xué)生設(shè)置具體的動(dòng)手操作步驟。使得學(xué)生對(duì)信息反饋遲鈍，印象不深刻，不容易掌握方法。生物信息學(xué)實(shí)踐教學(xué)并不需要價(jià)格昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，只需要一網(wǎng)的電腦和一些相關(guān)的分析軟件便可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然而，目前的狀況是，生物信息學(xué)課程中真正開展實(shí)踐性教學(xué)的內(nèi)容少之又少。
生物信息學(xué)的學(xué)習(xí)是一個(gè)長(zhǎng)期積累的過程，教學(xué)水平的提高也需要在大量的教學(xué)實(shí)踐中不斷總結(jié)和完善。我們通過分析發(fā)現(xiàn)，在師范院校生物信息學(xué)教學(xué)中仍存在很多問題，其原因是多方面的，需要教學(xué)工作者進(jìn)一步深入探討并提出切實(shí)可行的策略。
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一、心理因素的分析
現(xiàn)代研究已證明：男生和女生的智能總的來說是相當(dāng)?shù)?，這已成為一個(gè)不爭(zhēng)的結(jié)論。然而造成女生高中階段物理成績(jī)不如男生的原因是什么？究其根本，造成這一嚴(yán)峻現(xiàn)實(shí)的原因主要是女生的心理問題，如興趣差異、能力差異、性格差異等等。
1. 興趣差異
心理學(xué)研究表明，學(xué)習(xí)興趣的水平對(duì)學(xué)習(xí)效果有較大的影響，在一般情況下男女生學(xué)習(xí)物理興趣是不同的。女生較富于情感，其活動(dòng)往往多定向于人，男生的活動(dòng)傾向比較集中于物（物理學(xué)是研究“物”的）。從幼年起女性的興趣和注意中心就是人及其直接的日常生活方面，而使男性感興趣的客體所賴以存在的空間卻是無限的，男生樂于探究且比女生更擅長(zhǎng)思考較復(fù)雜的問題，男生比女生對(duì)物理更感興趣，學(xué)習(xí)主動(dòng)性強(qiáng)一些；男生的好奇心比女生強(qiáng)，這種不同的學(xué)習(xí)興趣自然要影響學(xué)習(xí)效果。這樣，女生學(xué)習(xí)物理的態(tài)度就比較被動(dòng)，遇到困難時(shí)往往信心不足，從而一定程度上影響了學(xué)習(xí)物理這門課程的積極性和主觀能動(dòng)性。
2. 能力差異
能力是在人的先天素質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過后天實(shí)踐的鍛煉和學(xué)習(xí)發(fā)展起來的，而男女生在知覺、記憶、想象、語言和思維等方面，都表現(xiàn)有能力上的差異。男生智能更傾向于概括，因而他們能夠較早地發(fā)展區(qū)分主次的能力。而女生在學(xué)習(xí)中雖然有較高的準(zhǔn)確性，但缺乏整體性和對(duì)事物的總體把握。男生在閱讀教材時(shí)對(duì)插圖、實(shí)驗(yàn)裝置、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象比較注意，而女生更多注意課本中的概念、規(guī)律等結(jié)論，對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象往往缺乏整體觀念，動(dòng)手時(shí)有部分女生又有膽怯感。物理學(xué)科是一門實(shí)驗(yàn)學(xué)科，物理概念及其規(guī)律是建立在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，久而久之，女生學(xué)習(xí)物理的困難就比較明顯，這也是女生學(xué)習(xí)物理感到困難的主觀原因。男女生在思維發(fā)展上的差異，主要表現(xiàn)在深刻性、靈活性、邏輯性和批評(píng)性等方面。男生思維多傾向于抽象思維，在思維品質(zhì)上，無論是思維的深刻性還是靈活性、邏輯性和批判性，一般男生大都優(yōu)于女生。而在高中物理學(xué)習(xí)中，抽象思維多于靜態(tài)思維，大部分女生對(duì)這一思維方式較難適應(yīng)，從而對(duì)學(xué)習(xí)物理產(chǎn)生了思維上的困難。
3. 心理品質(zhì)差異
女生情感細(xì)膩而缺乏自我肯定易受暗示，很在乎他人的評(píng)價(jià)，他人的一言一行都可能引起女生的注意，從而影響其自我評(píng)價(jià)。良好的人際關(guān)系應(yīng)建立在心理相容的基礎(chǔ)上，但女生往往具有戒備心理，心理上互不相容，一遇小事，雙方的關(guān)系就往往表現(xiàn)為排斥和摩擦，人際關(guān)系較差。另外女生較易感情用事，常把許多精力耗在無謂的人際關(guān)系處理上，影響了學(xué)業(yè)。
4. 其它方面
性發(fā)育帶來了困惑和不安。發(fā)育早的女孩怕人家議論，發(fā)育晚的則會(huì)為此不安，甚至擔(dān)心有什么毛病，總之，不論高矮胖瘦，女生們多少都會(huì)有為體型變化而不安、焦慮，而男生則少了這些麻煩。
二、改進(jìn)措施
1. 培養(yǎng)女生學(xué)習(xí)的興趣，增強(qiáng)女生學(xué)好物理的自信心。
根據(jù)女生的心理特點(diǎn)，教師應(yīng)注意到自己的作用，做到因材施教，對(duì)女生在學(xué)習(xí)上取得的成功的時(shí)候，教師應(yīng)及時(shí)地給予表揚(yáng)，使她們嘗到成功的樂趣，這樣既能促使她們產(chǎn)生進(jìn)一步滿足的愿望，又能樹立自信自強(qiáng)的信念，并形成更高的滿足需要的動(dòng)力機(jī)制。教師在復(fù)習(xí)時(shí)可調(diào)整教學(xué)內(nèi)容及方法、容量及深度。章節(jié)考試結(jié)果表明男女生成績(jī)差異最大的是《動(dòng)量》、《機(jī)械能》兩章。在平時(shí)的教學(xué)中，還要多提問女生，多開展演示實(shí)驗(yàn)，組織興趣小組。同時(shí)要通過多種方式和途徑，全方位地真實(shí)地掌握女生的心理實(shí)情，以對(duì)癥下藥。這樣就能提高女生學(xué)習(xí)物理的興趣，產(chǎn)生積極的學(xué)習(xí)動(dòng)力。
2. 注意教學(xué)的直觀性。
高中物理在研究復(fù)雜物理現(xiàn)象時(shí)，為了使問題簡(jiǎn)化，經(jīng)常只考慮其主要因素而忽略其次要因素，建立物理的模型，使物理概念和規(guī)律抽象化。例如，把物體當(dāng)成質(zhì)點(diǎn)來研究物體做勻變速直線運(yùn)動(dòng)時(shí)，不少女生對(duì)即時(shí)速度、加速度等物理量感到很抽象。我們可以通過氣墊導(dǎo)軌和數(shù)字計(jì)數(shù)器測(cè)定滑塊的既時(shí)速度和加速度，使學(xué)生能夠通過具體的物理現(xiàn)象來建立物理概念，提高女生的變通能力和靈活性，使其克服悟性不夠的缺點(diǎn)，讓感性認(rèn)識(shí)上升到理性認(rèn)識(shí)。
3. 加強(qiáng)觀察力的培養(yǎng)。
女生對(duì)周圍的事物的觀察往往缺乏針對(duì)性，缺乏整體觀念。比如說，燈泡是大家很熟悉的，但很多女生都沒有注意到燈泡的兩個(gè)通電觸腳，在用萬用表測(cè)燈泡電阻的學(xué)生實(shí)驗(yàn)中，很多女生測(cè)燈頭上兩個(gè)卡腳間的電阻。再如變阻器的連接中，很多女生往往會(huì)連在上面或下面兩個(gè)接線上使變阻器電阻為零或?yàn)槎ㄖ惦娮琛?/p>
物理學(xué)是一門以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的科學(xué)，而實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的第一個(gè)特點(diǎn)就是有目的地觀察。
三、結(jié)果分析與討論
通過對(duì)策的實(shí)施，大部分女生的自信心、學(xué)習(xí)方法、學(xué)習(xí)物理興趣大大增強(qiáng)，心理承受能力、組織活動(dòng)能力、抽象思維能力得到加強(qiáng)，部分女生的人際關(guān)系不良、性情狐僻、怪異、猜疑、緊張焦慮癥得到改善，大部分女生變得熱情、開朗而富有朝氣，鉆研精神也大大提高。
這樣就可以增強(qiáng)她們的自信心，避免形成自卑感，達(dá)到蘇霍姆林斯基所言的“讓每個(gè)孩子都能抬起頭來走路”的教學(xué)境界，最終使學(xué)生得到全面發(fā)展。
綜上所述，已初步得出了高中女生學(xué)習(xí)物理的成績(jī)差異的心理因素和對(duì)策，探索出了女生心理問題在學(xué)習(xí)物理上的可行性路子，使高中女生的學(xué)習(xí)物理的心理素質(zhì)得到了顯著的提高，促進(jìn)了她們學(xué)習(xí)物理的興趣和信心。
參考文獻(xiàn)：