摘要：目的建立一種可用于隱孢子蟲檢測的重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增(RAA)方法,并對其檢測敏感性和特異性進(jìn)行評價(jià)。方法以隱孢子蟲屬特異性18S rRNA核酸序列作為檢測靶標(biāo),采用Amplfix軟件設(shè)計(jì)、合成引物及熒光檢測探針,構(gòu)建并優(yōu)化RAA熒光反應(yīng)體系;分別以不同拷貝數(shù)的含18S rRNA靶序列的重組質(zhì)粒、不同濃度隱孢子蟲卵囊基因組DNA及不同數(shù)量隱孢子蟲卵囊基因組DNA為模板進(jìn)行RAA熒光法檢測,以評價(jià)其敏感性;分別以隱孢子蟲卵囊、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲包囊、日本血吸蟲蟲卵、似蚓蛔線蟲蟲卵、華支睪吸蟲蟲卵、沙門氏菌、志賀氏菌基因組DNA為模板進(jìn)行RAA熒光法檢測,以評價(jià)其特異性。結(jié)果成功建立了隱孢子蟲檢測RAA法,該方法可在39℃、20 min內(nèi)得到隱孢子蟲屬18S rRNA基因片段的有效擴(kuò)增。以不同拷貝數(shù)的含18S rRNA靶序列的重組質(zhì)粒、不同濃度隱孢子蟲卵囊基因組DNA及不同數(shù)量隱孢子蟲卵囊基因組DNA為模板,該方法最低檢出限分別為102拷貝/μL、1 pg/μL和1個(gè)/50μL;以藍(lán)氏賈第鞭毛蟲包囊、日本血吸蟲蟲卵、似蚓蛔線蟲蟲卵、華支睪吸蟲蟲卵、沙門氏菌、志賀氏菌基因組DNA為模板的熒光RAA擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。結(jié)論成功建立了一種可用于檢測隱孢子蟲卵囊DNA的RAA法,該方法操作簡便、反應(yīng)快速,敏感性和特異性均較好。